Course
Okvirni sadržaj:
P1 (2 sata) Predavanje: Osnovne karakteristike antitijela i dizajn eksperimenata s višestrukim bojenjem - U kratkom uvodu, ponovit će se znanje o strukturi antitijela. Obuhvatit će se tehnike označavanja antitijela fluoroforima, biotinom i enzimima. Zatim će se kroz nekoliko primjera detaljno prikazati što treba uzeti u obzir prilikom provođenja eksperimenta koji uključuje višestruko bojenje.
P2 (1 sat) Predavanje: Bioinformatički alati za analizu strukture proteina i antitijela - 3D prikaz kompleksa, proteina i antitijela
P3 (2 sata) Predavanje: ELISA principi za mjerenje proteina u istraživačkim i dijagnostičkim laboratorijima - Na temelju usvojenih načela direktnih i indirektnih metoda ELISA, bit će predstavljen napredni dizajn laboratorijskog eksperimenta za određivanje proteinskih analita (npr. tumorskih markera ili proteina upalnih markera iz krvi). Bit će raspravljeno i nekoliko složenijih oblika metode, poput kompetitivne ELISA. Također će biti predstavljeni odobreni dijagnostički kitovi, poput testa za imunoglobulin IgG radi određivanja titra antitijela na SARS-CoV-2 ili preosjetljivost na hranu.
P4 (2 sata) Predavanje: Upotreba Western blottinga i naprednih metoda imunoprecipitacije u istraživanju i dijagnostici - Bit će predstavljene metode u kojima je visoka osjetljivost Western blotting metode i njezina sposobnost otkrivanja proteina različitih veličina pronašla primjenu u medicinskoj dijagnostici. Primjeri su borelioza, Creutzfeldt-Jakobova bolest i određene vrste virusnih infekcija. Također će biti obuhvaćeni napredni materijali poput magnetskih kuglica, posebnih značajki imunoprecipitacije iz uzoraka krvi kao kompleksne mješavine bogate proteinima, albuminom i samim antitijelima, itd.
P5 (1 sat) Predavanje: Osnove analize rezultata citometrije protoka - protočna citometrija je osnovna metoda imunološke analize proteina na stanicama, posebno u slučaju analize proteina na površini stanica. Kratko će se uz primjere pojasniti histogram i točkasta (dot-plot) prezentacija rezultata kao osnova za razumijevanje literature u eksperimentalnoj medicini.
L6 (2 sata) Predavanje: Imunofluorescencija s analizom konfokalnog mikroskopa - metoda imunofluorescentne mikroskopije važna je za analizu proteina u stanicama i tkivima. Slijedeći principe imunofluorescencije i njezine primjene u konfokalnim mikroskopskim metodama, okosnicu predavanja čini dizajn naprednih eksperimenata i priprema za izvođenje jednostavnih eksperimenata s višestrukim bojenjem (V2 i V3) pripravaka staničnih kultura pomoću fluorescentno označenih antitijela i analiza konfokalnim mikroskopom. Također će se kratko objasniti principi naprednih metoda poput FRET (fluorescentna rezonancijska energijska transferna) metoda za određivanje interakcije proteina i metoda mikroskopije s dvofotonskim pobuđenjem za analizu debljih uzoraka poput organotipskih modela.
V1 (1 sat) Eksperimentalni rad: Dizajn eksperimenta s višestrukim imunobojenjem. Studenti će rješavati individualne zadatke sa ciljem pronalaska odgovarajućih antitijela putem izvora s interneta koja će im omogućiti imunofluorescentno bojenje prethodno dodijeljenih proteina u uzorku.
V2 (5 sati) Eksperimentalni rad: Priprema uzoraka za imunofluorescentnu mikroskopiju - bojenje (do 4 boje) na uzorcima staničnih kultura
V3 (3 sata) Eksperimentalni rad: Analiza uzoraka na konfokalnom mikroskopu
Seminari (6 sati): Planirane su kratke prezentacije studenata uz raspravu
Cilj predmeta je pomoći studentima da prodube netom stečena i usvoje napredna znanja o imunoanalizi proteina, tj. o metodama analize proteina koje se temelje na upotrebi protutijela. Ova vrsta analiza osnova je mnogih istraživačkih i dijagnostičkih postupaka te će njihovo razumijevanje studenti moći iskoristiti u primjerice kliničkoj imunologiji, infektologiji, mikrobiologiji, onkologiji, patologiji i molekularnoj dijagnostici. Očekuje se osnovno predznanje iz biologije proteina i imunoloških laboratorijskih metoda te izražen interes za znanja iz područja molekularne dijagnostike i molekularnih mehanizama u zdravlju i bolesti.
Robert K. Murray et al.: Harperova ilustrirana biokemija – odabrana poglavlja
Berg JM, Tymoczko JL, and Stryer L: Biochemistry Stryer – odabrana poglavlja
Odabrani znanstveni i stručni radovi i pregledni radovi iz okvira kolegija
redovito pohađanje nastave (predavanja, seminari, vježbe)
izrada seminarskog rada/polaganje završnog ispita
Learning outcomes
P1 (2h) Osnovna obilježja protutijela i dizajn pokusa s viže vrsta protutijela – u kratkom uvodu bit će utvrđeno
znanje o strukturi protutijela. Obradit će se tehnike obilježavanja protutijela fluoroforama, biotinom i enzimima.
Potom će se na nekoliko primjera podrobno prikazati o čemu treba voditi računa kod izvođenja pokusa koji
uključuje više vrsta protutijela i višestruko bojenje preparata.
Student će biti osposobljen da:
1. Definira sljedeće pojmove koji su vezani uz metode imuno-analize proteina: primarna i sekundarna protutijela, kros-reaktivnost protutijela, obilježavanje protutijela, podrijetlo protutijela (vrsta), izotip protutijela, dijagnostički kit
Learning outcomes
P2 (1h) Bioinformatički alati za analizu strukture proteina i protutijela – 3D prikaz kompleksa, proteina, protutijela
Student će biti osposobljen da:
1. Opiše osnovna obilježja kompleksa proteina i protutijela
2. Pronađe alate koji omogućavaju jednostavnu vizualizaciju strukture proteina
Learning outcomes
P3 (2h) ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) za mjerenje proteina u istraživačkim i dijagnostičkim laboratorijima – nastavno na usvojene principe direktne i indirektne ELISA metode, bit će izložen napredan dizajn laboratorijskog pokusa za određivanje proteinskih analita (primjerice eksperimentalnih solubilnih tumorskih markera ili proteina markera upale, iz krvi) temeljenog na tenhnici ELISA te neki složeniji oblici izvedbe ove metode, poput kompetitivne ELISA-e. Nadalje, bit će obrađeno nekoliko kitova koji su odobreni za upotrebu u dijagnostici, a temelje se na tehnici ELISA: poput testa imunoglobulina IgG u svrhu određivanja protutijela na SARS-CoV-2 ili preosjetljivosti na hranu.
Student će biti osobosobljen da:
1. Raspravlja o prednostima i ograničenjima metoda ELISA u laboratorijskoj praksi
2. Raspravlja o čimbenicima koji otežavaju analizu proteina u krvi
Learning outcomes
P4 (2h) Upotreba Western blottinga i naprednih metoda imunotaloženja u istraživanjima i dijagnostici – nastavno na
usvojene temeljne principe imunotaloženja i Western blottinga, bit će izloženo nekoliko metoda u kojima je velika
osjetljivost metode Western blot i njena sposobnost da, za razliku od metode ELISA, ukaže na proteinske
forme različite veličine našla primjenu u medicinskoj dijagnostici. Primjeri su borelioza, Creutzfeldt-Jakobova bolest
te neke vrste virusnih infekcija. Nadalje, obradit će se napredni materijali za provođenje metode imunotaloženja,
poput magnetskih kuglica, koje za razliku od klasičnih metoda unose mnogo manje onečišćenja u sustav, a što je
od posebne važnosti za imunotaloženja iz uzoraka krvi, kao složene smjese koja obiluje proteinom albuminom i
samim protutijelima.
Student će biti osposobljen da:
1. Raspravlja o prednostima i ograničenjima metode Western blot/imunoblot u laboratorijskoj praksi
Learning outcomes
P5 (1h) Osnove analize rezultata protočne citometrije – protočna citometrija je osnovna metoda imunoanalize proteina na stanicama, bez konkurencije u slučaju analize površinskih proteina. Unutar kratkog predavanja utvrdit će se temelji histogramskog i ‘dot blot’ prikaza rezultata kao osnove za nesmetano praćenje literature u (eksperimentalnoj) medicini.
Student će biti osposobljen da:
1. Opiše osnovne prikaze rezultata protočne citometrije i njenu prednost u analizi proteina stanične površine
Learning outcomes
P6 (2h) Imunofluorescencija s analizom konfokalnim mikroskopom – metoda imunofluorescentne mikroskopije je važna imunološka laboratorijska metoda za analizu proteina u stanicama i tkivima. Nastavno na principe imunofluorescencije i njezine primjene u metodama konfoklane mikroskopije, okosnica predavanja bit će dizajniranje naprednih pokusa i priprema za izvođenje jednostavnih pokusa višestrukog bojanja (V2 i V3) preparata staničnih kultura fluorescentno obilježenim protutijelima uz analizu konfokalnim mikroskopom. Ukratko će se izložiti i principi naprednih metoda poput primjerice metode FRET (Fluorescence resonance energy transfer) za određivanje interakcije proteina i metode dvofotonske mikroskopije (Two-photon excitation microscopy) za analizu uzoraka veće debljine, poput organotipskih modela.
Student će biti osposobljen da:
1. Definira sljedeće pojmove koji su vezani uz metode imunofluorescentne analize proteina: fluorofora, konfokalno, autofluorescencija
Learning outcomes
V1 (1h) Dizajn vlastitog pokusa s višestrukim imuno-bojenjem preparata. Studenti će rješavati individualne zadatke sa ciljem pronalaska odgovarajućih protutijela putem izvora s interneta koja će im omogućiti imunofluorescentno bojanje više zadanih proteina u preparatu.
Student će biti osposobljen da:
- Samostalno provede odabir protutijela za bilo koji eksperiment koji uključuje višestruko imuno-bojanje
Learning outcomes
V2 (5h) Priprava preparata za imunofluorescentnu mikroskopiju – višestruko bojanje (do 4 boje) na uzorcima staničnih kultura.
Student će biti osposobljen da:
- Samostalno provede bojanje preparata staničnih kultura protutijelima uz nadzor
Learning outcomes
V3 (3h) Analiza preparata na konfokalnom fluorescentnom mikroskopu
Student će biti osposobljen da:
- Procijeni i argumentira rezultate fluorescentne mkikroskopije
Learning outcomes
Seminari (6h): Predviđene su kratke prezentacije studenata uz raspravu iz sadržaja teme kolegija i relevantne znanstvene literature ili literature vezane uz dijagnostičke postupke
| Academic year | |
|---|---|
| 2021/2022 | [Download] |